تست TE ( ESCULIN – TWEEN 60 )
این محیط برای جداسازی گونه هایی که توانایی هیدرولیز اسکولین و استفاده از توئین 40 را دارند ، بکار می
رود . ترکیبات این محیط شامل پپتون گلوکز ، عصاره مخمر ، ستیرات آمونیوم ، آهن و توئین 60 است . در گونه های مالاسزیا پاکی درماتیس ، مالاسزیاسمپودیالیس ، مالاسزیاژاپونیکوم و مالاسزیافورفورتست TE مثبت هستند . به این صورت که اطراف کلنی هاله سیاه تولید می شود که علت آن تولیدات هیدرولیز اسکولین و نمک آهن فریک به خاطر ترشح آنزیم بتاگلوکوزید از در محیط می باشد (62).
تست EL ( CREMOPHOR EL )
این تست توانایی جذب روغن کاستور ] ( CREMOPHOR EL ) CASTOR OIL 35 – PEG [ را توسط گونه های مالاسزیا نشان می دهد . این تست فقط در مالاسزیا فور فور مثبت است (55).
تست جذب توئین
مهم ترین تست فیزیولوژیکی برای افتراق گونه های مالاسزیا ، تست آسیمیلاسیون چربی یا جذب توئین ) T80 و T60 ، T40 ، T20 ) است .
واکنش اوره آز
این محیط شامل اوره و معرف فنل رد است . فقط مالاسزیافورفور و مالاسزیا پاکی درماتیس توانایی تولید آنزیم اوره آز را دارند اما بفیه مالاسزیا اوره آز منفی هستند (87) .
رشد روی محیط دیکسون آگار اصلاح شده در 3 درجه دمایی 32، 37 و 40 درجه سانتی گراد

تقریباً تمام گونه ها در 32 و 37 درجه سانتی گراد رشد می کنند اما فقط گونه های مالاسزیا فور فور،مالاسزیا پاکی درماتیس ،مالاسزیا سمپودیالیس ،مالاسزیا اسلوفیه ،مالاسزیا درماتیس در 40 درجه سانتیگراد قادر به رشد کردن هستند (55).
روشهای مولکولی
روش های فنوتیپی که توضیح داده شد روش هایی هستند که بصورت رایج برای شناسایی و افتراق گونه ها استفاده می شود. در سال های اخیر روشهای مولکولی پیشرفت های زیادی داشته اند و به خاطر مزایایی که دارند، جایگزین روش های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی شده اند. روش های فنوتیپی وقت گیر و چند مرحله ای بوده و به تکنیکهای آزمایشگاهی زیادی نیاز دارند. علاوه بر این به علت تشابهاتی که در خصوصیات فیزیولوژی و مورفولوژی بعضی مثل مالاسزیا فورفور، مالاسزیا سمپودیالیس و مالاسزیا اسلوفیه وجود دارد (40) و همچنین با مشاهده استرین های مالاسزیا با خصوصیات فیزیولوژیکی غیر معمول (29و30)، استفاده از این روش ها در تمایزگونه ها ابهام و سردرگمی بوجود می آورد (19و41).
مطالعات زیادی وجود دارند که نشان دهنده اختلاف نتایج روش های فنوتیپی و کشت با روش های مولکولی است. از جمله مطالعه Makimura که در سال2000 انجام شد ، 46 ایزوله بالینی را ابتدا با روش های فنوتیپی و سپس باسکوئنسینگ ناحیهITS-1 شناسایی کرد. در روش های فنوتیپی استفاده شده، 46 ایزوله بعنوان مالاسزیا فورفور شناسایی شدند ولی باسکوئنسینگ ناحیه ITS-1 از ، 22 تا از 46 ایزوله، مالاسزیا سمپودیالیس و5 تا مالاسزیا اسلوفیا شناسایی شدند (27).
در مطالعه دیگری که در سال 2000، Nakabayashi و همکاران از روش کشت برای تشخیص گونه ها در افراد سالم و بیمار (پیتریازیس ورسیکالر و سوریازیس) استفاده کرد، نتایج به این صورت بودکه در افراد سالم و بیمار، مالاسزیا گلوبوزا فراوان ترین ایزوله بود ولی مطالعات دیگر با استفاده از روش های تشخیصی مولکولی مثل Nested-PCR و Real-time روی افراد سالم و بیمار (پیتریازیس ورسی کالر، سوریازیس و درماتیت آتوپیک)، نشان دادندکه فراوان ترین ایزوله مالاسزیا رستریکتا و مالاسزیا گلوبوزا بودند (72و81). تفاوت بین روش های مولکولی و تکنیک های کشت نشان دهنده خطای در کشت است که علت آن می تواند به خاطر برداشت آرتی فکت از کشت به جای نمونه باشد و یا اینکه محیط کشت استفاده شده به طور استاندارد و دقیق ساخته نشده باشد (27).
از دیگرمعایب روش های فنوتیپی این است که اجزای علم رده بندی را در بر نمی گیرند و با استفاده از این روش ها ارتباط ژنتیکی بین گونه ها را نمی توان تعیین کرد. بنابراین استفاده از روش های مورفولوژی و فیزیولوژیکی رایج برای تشخیص گونه های مالاسزیا باعث محدودیت در تشخیص و طبقه بندی گونه های جدید می شود. در سال های اخیر برای غلبه بر این محدودیت ها و درک بهتر اپیدمیولوژی و اکولوژی گونه های مالاسزیا و نیز ارتباط آنها با بیماری ها استفاده از روش های مولکولی مختلف رایج شده است (27و42و43و79) که شامل، Nested-PCR ،PFGE ، DGGE، RFLP، Tflp، SSCP، RAPD، AFLP، Real-time PCR، Sequence می باشند (70و71). بطور کلی برای تشخیص ارگانیسم ها با استفاده از PCR، به نواحی هدف DNA مناسب که لوکوس یا مارکر ژنتیکی نامیده می شوند، نیاز است.
مارکرهای ژنتیکی مختلف شامل کمپلکس ژنی rDNA هسته ایی، ژن کیتین سنتاز 2 (Chs-2) و ژن زیر واحد یک RNA پلی مراز اخیرا به منظور شناسایی گونه های مختلف مالاسزیا استفاده می شوند (25و82). مطالعات زیادی نشان می دهند که از نواحی 1ITS-1، ITS-2، 2IGS-1 و دومنهای D (D1 و D2) و زیر واحد بزرگ DNA ریبوزومی که در کمپلکس ژنی rDNA قرار دارند، می توان بعنوان مارکرهای ژنتیکی معتبر برای شناسایی گونه های مالاسزیا استفاده کرد (63).
توالی یک مارکر ژنتیکی در گونه های مختلف یک جنس قارچی، باید به اندازه کافی با هم فرق داشته باشند، تا بتوان از آنها برای شناسایی اختصاصی گونه ها استفاده کرد. ولی اختلافات این مارکرها در داخل یک گونه جزئی است یا اصلا وجود ندارد. در مقابل به منظور شناسایی استرین ها، اختلاف قابل توجهی در توالی هر مارکر ژنتیکی داخل یک گونه وجود دارد.
کمپلکس ژنی rDNA
کمپلکس ژنی rDNA یک کمپلکس چند نسخه ای (Multi copious) است که در تمام میکروارگانیسم ها وجود دارد. توالی هر نسخه مشابه نسخه های دیگر در داخل آن فرد یا گونه است. جزئیات ساختاری این کمپلکس در گروه های مختلف ارگانیسم های یوکاریوتی ممکن است اندکی متفاوت باشد اما ساختمان تیپیک این کمپلکس متشکل از واحدهای تکراری (unit repeat) است که هر واحد از ژنهای کد کننده 18S ، 5.8S و 28S و نواحی غیر کد کننده فاصله انداز رونویسی1 شامل نواحی ITS و2ETS تشکیل شده است. واحدهای تکراری، توسط نواحی فاصله انداز داخلی3 از هم جدا می شوند (50). کمپلکس ژنی rDNA دارای بخش های مختلف محافظت شده و متغیر است که بسته به اهداف تشخیصی یا تحقیقی می تواند برای شناسایی میکروارگانیسم ها در حد جنس وگونه یا فوق جنس و زیر گونه بکار رود. این نواحی مارکرهای مناسبی برای تعیین جایگاه تاکسونومیک بیشتر قارچ ها ازجمله مالاسزیاها می باشد. (16).
تعیین توالی ناحیه ITS، در مطالعات مختلف جهت شناسایی قارچ های مختلف از جمله درماتوفیت ها، گونه های کاندیدا، قارچ های سیاه، گونه های مالاسزیا و غیره مورد استفاده قرار گرفته است و شاید بتوان گفت هیچ مارکری در میان قارچ ها به اندازه مارکر ITS تعیین توالی نشده است (50).
ناحیه ITS به یک قطعه DNA فاقد عملکرد نسبت داده می شود که بین نواحی 18S و 28S در rDNA قرار دارد. درطول بلوغ rRNA ، ITS و ETS جدا می شوند و بعنوان محصولات فرعی فاقد عملکرد به سرعت از بین می روند. از ناحیه ITS، بعلت تنوع توالی نوکلئوتیدی بالائی که دارد، می توان برای افتراق گونه ها و حتی تشخیص داخل گونه ایی استفاده کرد. بنابراین با مقایسه سکانس ناحیه ITS بطور وسیعی در تاکسونومی و فیلوژنی قارچ ها می توان استفاده کرد. این امر بعلت تعداد کپی های زیاد ژن rRNA است که در نتیجه با مقدار کم DNA هم می توان این ناحیه را تکثیر کرد (50و51). برای مثال از ناحیه ITS-1 برای تمایز 7 گونه مالاسزیا با رنج 70-26? اختلاف در توالی نوکلئوتیدی، استفاده شد. همچنین اختلافات داخل گونه ای با رنج 8/2-7/1? اختلاف در توالی نوکلئوتیدی ناحیه ITS-1 در گونه های مالاسزیا فورفور، مالاسزیا سمپودیالیس، مالاسزیا اسلوفیا و مالاسزیا پاکی درماتیس شناسایی شدند (51). بعد از سال 1996با استفاده از اختلاف در توالی ITS-1، گونه مالاسزیا ژاپونیکا معرفی شد(70). Makimura و همکاران درمطالعه ایی که روی گونه های مالاسزیا در سال 2000 بر اساس توالی ITS-1 انجام دادند، 22 ایزوله از مالاسزیا سمپودیالیس را به 3 گروه تقسیم بندی کردند که 84? ایزوله ها به گروه یک تعلق داشت (63).
ژن chs-2
آنالیز ژن Chs-2 نشان می دهد که این ژن توانایی تمایز 7 گونه مالاسزیا را دارد، با توجه به اینکه 95? شباهت در سکانس گونه ها در این ژن وجود دارد (56). با استفاده از ژن Chs-2 در نمونه های بالینی مالاسزیا پاکی درماتیس از گربه ها و سگها، 4 ژنوتیپ تشخیص داده شده است (A,B,C,D) که به ضایعات پوستی یا اوتیت مربوط می شوند. اخیرا برای ژنوتیپ مالاسزیا پاکی درماتیس از آنالیز توالی مولتی لوکوس(ITS-1, LSU و ژن Chs-2) استفاده شد که با استفاده از این توالی 3 ژنوتیپ (A، B و C) برای آن تعریف شد (20). 2 تا از این ژنوتیپ ها مربوط به ضایعات پوستی بودندکه مخمرها در این موارد فعالیت ففولیپاز بالائی داشتند. ولی ژنوتیپ سوم از پوست افراد سالم که فعالیت فسفولیپازپائین داشتند بدست آمد (21و29). توالی مولتی لوکوس همچنین برای شناسایی و تمایز گونه هایی که با استفاده از روش های مورفولوژیکی وفیزیولوژیکی به سختی شناسایی می شوند، استفاده می شود (29و30).
هدف ا ز این طرح تعیین گونه های مالاسزیا جدا شده از بیماران مبتلا به پیتریازیس ورسیکالر به کمک محیط کشت کروم آگار اصلاح شده و تایید آن به روش PCR در شهر اهواز می باشد.با توجه به توزیع متفاوت گونه های مالاسزیا در نواحی مختلف جغرافیایی وهمچنین حساسیت متفاوت گونه های مختلف به داروهای ضد قارچی،با شناسایی دقیق گونه های مالاسزیا،درمان بیماری های مرتبط با آن تسهیل خواهد شد(31).
روشهای تکثیر نوکلئیک اسید در آزمایشگاه
(Nucleic acid multiplication method in lab):
1) تکثیر سیگنال
2) تکثیر پروب
3) تکثیر هدف: شامل تکنیک PCR است(57).
واکنش زنجیره ای پلی مراز(PCR)
پیشرفت های 2 دهه اخیر در زمینه بیولوژی مولکولی موجب ارتقاء کارایی و تکامل هرچه بیشتر آزمایش های وابسته به DNA در علوم بالینی گردیده است. یکی از مهمترین این پیشرفت ها در زمینه بیولوژی مولکولی که در عین حال کاربرد تشخیصی نیز دارد، PCR می باشد که علاوه بر سریع نمودن آزمایش های وابسته به DNA در موارد متعدد موجب افزایش حساسیت این گونه آزمایش ها گردیده است. به طور کلی PCR به روش ازدیاد مقادیر جزئی DNA یا RNA (ازدیاد RNA با روش RT-PCR امکانپذیر است) تا حد مشاهده آنها توسط روش های ساده و رایج آزمایشگاهی اطلاق می شود.
قابلیت PCR در ازدیاد اسیدهای نوکلئیک موجود در نمونه مورد آزمایش، موجب شناسایی سریع و اختصاصی نوع سلول یا میکروارگانیسم مورد نظر در نمونه مذکور می گرددکه این ویژگی علاوه بر بکارگیری PCR در تشخیص آزمایشگاهی بیماری ها،آن را بعنوان ابزاری مطمئن و حساس در زمینه پژوهش های علمی مطرح می سازد. از زمان معرفی PCR در سال 1988، بکارگیری آن در تحقیقات بیولوژیکی پایه و کاربردی، موجب ایجاد تغییرات اساسی گردیده است. این تکنیک آزمایشگاهی برای نخستین بار توسط کری مولیس 2 در سال 1988 معرفی گردید. روش PCR تنها برای توالی هایی مورد استفاده قرار می گیرد که از قبل شناخته شده باشد. همچنین قطعات بسیار بزرگ توانایی تکثیر با PCR را ندارند(72).
مواد مورد نیاز جهت انجام تکنیک PCR
آنزیم DNA پلی مراز3 : برای تکثیر یک قطعه DNA نیاز به DNA پلی مراز است. در ابتدای طراحی PCR
از آنزیم DNA پلیمراز E.coli استفاده شد ولی این آنزیم به حرارت حساس بود، لذا پس از هر بار حرارت دادن محیط واکنش تا دمای94 درجه سانتی گراد، افزودن آنزیم تازه به محیط لازم بود. یکی از مهمترین کشفیات در این زمینه استفاده از آنزیم Taq پلیمراز بود. این آنزیم از باکتری Termus aquaticus که یک میکروارگانیسم آبزی در آب های گرم است، جداسازی شده است. این آنزیم نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در حرارت بالا فعالیت بهتری دارد. یک مزیت بسیار مهم دیگر Taq پلی مراز افزایش حساسیت و دقت PCR است. معمولا حدود 5/1-1 واحد آنزیمTaq پلیمراز در یک واکنش 50 میکرولیتری استفاده می شود. غلظت های بالاتر ممکن است باعث سنتز محصولات غیر اختصاصی شود.
پرایمرها4 : DNA پلیمراز برای شروع سنتزنیاز به پرایمرها دارد. پرایمرها قطعات DNA بازسازی شده جهت تکثیر از روی DNA الگو می باشند. پرایمرها بصورت مکمل با بازهای DNA الگو طراحی می شوند. ایده آل آن است که پرایمرها تعداد مساوی از هر 4 باز را داشته باشند. پرایمرها در واکنش PCR در دو سوی توالی هدف متصل می شوند و بدین ترتیب فعالیت آنزیم DNA پلی مراز شروع می گردد. اتصال غیر اختصاصی پرایمرها خصوصا در انتهای ‘ 3 باعث تولید محصولات غیر اختصاصی DNA می شود. در طراحی پرایمرها چند عامل باید مد نظر قرار گیرد:
– پرایمرها تعیین کننده قسمت قابل تکثیر DNA باشند.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

– برای هر PCR، دو پرایمر طراحی گردد.
– طول پرایمرها معمولا 30-15 نوکلئوتید باشد.
– پرایمرها نباید مکمل یکدیگر باشند.
5dNTP:dNTP ها در واقع نقش سوبترای آنزیم DNA پلیمرازرا بر عهده دارند. وجود این مولکول ها برای واکنش PCR بیار مهم و ارزنده می باشد. این مولکول ها یا بصورت مخلوط و یا حتی به اشکال جداگانه مورد استفاده قرار می گیرند.
بافر مناسب: بافر PCR نقش مهمی در افزایش کارایی PCR و ممانعت از تجمع و اتصال مولکولهای پروتئینی آنزیم Taq DNA پلیمراز به یکدیگر دارد. بافر PCR معمولا شامل تریس با PH= 8.3-8.8 و یک نمک است که معمولا، KCL, MgCL2 و یا آمونیوم سولفات است.
MgCL2: از اجزاء مهم وتاثیر گذار واکنش PCR است که باعث افزایش و کارایی و بهینه کردن پرایمرها، توالی هدف، بافر و افزایش اتصال پرایمرها، جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی پرایمرها با توالی های غیر هدف، افزایش فعالیت آنزیم Taq DNA پلیمراز می شود. یونهای Mg?? با dNTP ها و پرایمرها و الگوی DNA تشکیل کمپلکس می دهند. مقدار MgCL2 بستگی به پرایمر و DNA از 1 الی 10 میلی مولار متغیراست.غلظت های کم MgCL2 منجر به کاهش محصولات PCR می شود و غلظت های زیاد آن موجب ایجاد محصولات غیر اختصاصی می گردد.
دستگاه ترموسایکلر 6: یکی از پیشرفت های عمده در زمینه PCR کشف دستگاه ترموسایکلر بود. ترموسایکلر در واقع بلوک های حرارتی قابل برنامه ریزی می باشند که بطور اتوماتیک حرارت های لازم را برای مراحل سه گانه PCR تولید می نماید ضمن اینکه تعداد چرخه های مورد نیاز برای انجام PCR و ازدیاد DNA به طور اتوماتیک در این دستگاه بوقوع می پیوندد (72و57).
طراحی پرایمر
قواعد مشخصی برای اینکه بتوان یک جفت پرایمر موثر را با اطمینان انتخاب کرد وجود ندارد. در حال حاضر پرایمر بیش از هر عامل دیگری عامل موفقیت و شکست در یک واکنش PCRاست. بعضی قواعد راهنمای های مفیدی را در مورد طراحی آغازگر به ما ارائه می کنند که ذیلا به آنها اشاره شده است:
– طول متوسط هر پرایمر بین 30-15 جفت باز باشد. پرایمر با طول کوچکتر اتصال غیراختصاصی را افزایش می دهد و پرایمر بزرگتر سرعت هیبریداسیون را کم می کند.
– مقدار C+G دو پرایمر با هم مشابه بوده و حدود 60-50? باشد.
– پرایمرها باید از نظر مکمل بودن با هم کنترل شوند.
پرایمردایمریا آغازگردوتایی یک تکثیرمصنوعی است که اغلب در محصول PCR مشاهده می شود وعبارت است ازیک قطعه دو رشته ای که طول آن تقریبا به مجموع دو پرایمر نزدیک است وهنگامی مشاهده می شود که یک پرایمرتوسط آنزیم پلیمراز به روی پرایمر دیگرگسترش یابد. مکانیسم واقعی چگونگی تشکیل پرایمردایمربه درستی مشخص نیست. درهرحال چنانچه پرایمردایمر به عنوان مانعی مشاهده شود می توان آن را تا حدودی با غلظت حداقل پرایمر وآنزیم کاهش داد.
– در انتهای’ 3 پرایمر باید حداقل C یا G قرار گیرد. در پرایمرهایی که توالی انتهای’ 3 آنها غنی از C+G است احتمال اتصال اشتباه افزایش می یابد.
– نسبت چهار نوع نوکلئوتید در پرایمر ها حتی المقدور یکسان باشد.

  • 1
دسته بندی : پایان نامه ها

پاسخ دهید